0.25%胰酶-EDTA的配制

2020/08/05 admin 27

细胞消化胰酶的配制


对一般细胞 0.25% 胰酶(胰蛋白酶,Trypsin)
配方:100ml PBS,0.25g胰酶

步骤:

1. 先配100ml PBS(可选HyperCyte货号:HC0058)

2. 称胰酶0.25g,加入PBS中,低速搅拌,〈4h冰浴中,或者4℃过夜

低速搅拌0.5h冰浴中调PH7.4

3. 无菌过滤,分装,-20℃保存,4℃短期内用完


Note:

低速很重要,机械搅拌对酶是一种冲击,如果起沫,酶就变性了。低温,防止酶失活

对难消化的细胞:在上述配方中,可加入0.02g的EDTA(0.02%),因为EDTA可以络合Ca2+ ,增加消化效力


注意:

1、胰酶浓度0.25%,即0.25g胰酶溶于100ml PBS中。注意,尽量不要用水来溶,因为要保持渗透压。

2、EDTA的工作液溶度是0.02%-0.1%(质量/体积比),根据细胞消化的难易程度可优化。EDTA并不是必须的,容易消化的细胞可不加。EDTA对细胞贴壁性有影响,因此使用时要慎重。如果影响贴壁,但消化时必须要用,那么在用完全培养基终止消化后,可离心弃上清,再加完全培养基培养,可去除EDTA。如果对贴壁没影响,那么可不离心。

3、血清可终止胰酶的作用,但不能终止EDTA的作用,对有些细胞来说,终止消化后的离心是必要的。

4、胰酶和EDTA在pH 为8左右时最易溶解,在配制时可先滴几滴NaOH将pH调至8,可用磁力搅拌器低速搅拌。注意,胰酶可使溶液变酸,所以要边溶边测pH,随时调整。注意,不可加过量NaOH,否则过碱会影响细胞生长。

5、可配2-3x(浓缩液)的胰酶,这样比较节约时间和滤器,用的时候对上灭菌PBS即可。

6、储存液放在-20度冰箱冻存,使用液放在4度,用的时候不要放在37度水浴锅温浴,因为这样会让胰酶很快失效,使用前可先室温平衡一下,因为加的量很少,所以一般不会冻坏细胞。

7、消化时,向培养瓶中加入适量胰酶,一般250px培养皿加入0.5ml足已,加入后,立刻摇晃培养皿,使胰酶铺满,一旦铺满,立刻用负压吸引器吸去多余的胰酶,再放入37度培养箱消化。

8、注意,过量的胰酶对细胞是有害的,而EDTA过多也会影响贴壁,所以没必要把细胞泡在胰酶里面消化。

9、胰酶37消化效果最好,低于37度也有消化能力,有些容易消化的细胞在消化时甚至不需要放入培养箱。注意,不可消化过久。

10、亦可使用温和的细胞消化液(HyperCyte货号:HC0145)替代胰酶对贴壁细胞进行消化,对细胞无损伤且不需要终止消化,无需离心去除。